Zastosowanie techniki PCR do wykrywania Listeria monocytogenes w rybach, produktach rybnych i środowisku przetwórstwa rybnego cz1 Artykuły firmy Kontakt do firmy

Zagrożeniem dla czystości mikrobiologicznej końcowej postaci środka spożywczego jakim są ryby (spożywane na surowo lub minimalnie przetworzone) i produkty rybne, może być zanieczyszczony surowiec (jako koszt chociażby braku odpowiedniej higieny procesu obróbki), niewłaściwa higiena procesu produkcyjnego (higiena osobista personelu, czystość powierzchni produkcyjnych urządzeń, woda technologiczna, powietrze, opakowania), ponadto zachowanie ciągłości łańcucha chłodniczego przechowywania, transportu i dystrybucji.

Nietrwałość mięsa ryb wynika z:

• wysokiej zawartości wody
• występowania niebiałkowych związków azotowych, m.in. wolnych aminokwasów (od 15% w mięsie ryb białych do 55% w mięsie ryb spodoustych w przeliczeniu na azot)
• wysokiej aktywności enzymów tkankowych i bakteryjnych już w temperaturze chłodniczej
• obecności krwi, gdyż po śmierci nie następuje wykrwawienie
• obecności drobnoustrojów (głównie bakterii) bytujących na powierzchni ryb, a w tuszach niepatroszonych również w przewodzie pokarmowym i skrzelach
• niewielkiego pośmiertnego spadku wartości pH, niewystarczającej do zahamowania rozwoju patogennej i gnilnej mikroflory

Na zanieczyszczenie mikrobiologiczne ryb (jako surowca), a w konsekwencji również na trwałość produktu finalnego wpływają dwie grupy czynników: przyżyciowe i pośmiertne.

Czynniki przyżyciowe:

• gatunek ryby
• genetyczne (np. płeć, w przypadku chowu i hodowli ryb konsumpcyjnych to także przynależność do konkretnej linii hodowlanej, ewentualnie odmiany lokalnej)
• fizjologiczne (wiek, stopień dojrzałości płciowej, ponadto sposób odżywiania, głównie rodzaj pokarmu, stopień wypełnienia przewodu pokarmowego, także aktywność metaboliczna uzależniona od pory roku, kondycja i stan zdrowotny)  
• środowiskowe (m.in. mikrobiologiczny stan wody na łowisku)
• rodzaj połowu i związany z nim stopień zmęczenia przedśmiertnego (połowy haczykowe, w przeciwieństwie do przemysłowych dostarczają ryb o lepszej jakości mikrobiologicznej).

Istotny wpływ na zanieczyszczenie i trwałość mikrobiologiczną ryb obok czynników przyżyciowych wywierają czynniki pośmiertne:

• temperatura wody i powietrza podczas połowu
• mikroflora gnilna pochodząca z wody, kału i śluzu ryb. W śluzie pokrywającym skórę ryb występuje około 102 – 107 jtk/cm2. Skład jakościowy dominującej mikroflory śluzu zależy przede wszystkim od gatunku ryby, czystości wód, stopnia zasolenia wód i temperatury. Śluz naskórny ma zdolność hamowania rozwoju niepożądanej mikroflory, zawiera m.in. lizozym i inne substancje bakteriostatyczne i bakteriobójcze. Po śmierci śluz, który za życia ryby stanowi warstwę ochronną, zostaje rozłożony a drobnoustroje obecne na powierzchni przenikają w głąb tkanek mięśniowych podczas przechowywania.
• ewentualna wstępna obróbka ryb po połowie, uszkodzenia skóry (wszelkie uszkodzenia skóry sprzyjają wnikaniu bakterii do mięśni oraz zwiększają ich zanieczyszczenie). Najwięcej bakterii znajduje się w przewodzie pokarmowym ryb, 103 – 108 jtk/g treści przewodu pokarmowego. Mikroflora przewodu pokarmowego ryb jest jakościowym odbiciem mikroflory bakteryjnej otaczającego środowiska. Ryby niepatroszone często przechowuje się lepiej niż patroszone, co można wytłumaczyć zanieczyszczeniem otwartych mięśni w trakcie patroszenia zarówno mikroflorą z przewodu pokarmowego, jak i z powierzchni ryby a także drobnoustrojami z narzędzi i rąk pracowników. Wynik patroszenia uzależniony jest w bardzo dużym stopniu od warunków higienicznych wykonywania ww. czynności. Jednak w sytuacji, gdy transport ryb z łowiska na ląd wymaga dłuższego okresu czasu, wówczas zabieg patroszenia wpływa korzystnie na jakość mikrobiologiczną surowca.
• odpowiednie zabezpieczenie ryb bezpośrednio po połowie, w celu ochrony przed zepsuciem. Ryby tuż po złowieniu, jeśli nie zostaną schłodzone lub w inny sposób zakonserwowane staną się niezdatne do spożycia w ciągu kliku, maksymalnie kilkunastu godzin. Powszechnie do chłodzenia ryb używa się lodu, który musi być otrzymany z wody odpowiadającej wymaganiom wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Przy prawidłowym lodowaniu temperatura tkanki ryb nie powinna być wyższa niż 1oC.
• stan higieniczny statku i sprzętu użytego do połowu (sieci często zanieczyszczone są drobnoustrojami ściekowymi  na skutek płukania w wodach przybrzeżnych), a także higieniczne warunki składowania i transportu ryb.

W celu przedłużenia trwałości ryb poddaje się je wielokierunkowym technologiom przerobu (wykorzystując rozmaite metody utrwalania surowca rybnego), uzyskując tym samym szeroki asortyment środków spożywczych – od ryb świeżych (chłodzenie), mrożonych, solonych, wędzonych, suszonych, marynat, wyrobów garmażeryjnych, aż do konserw i prezerw rybnych. Trwałość ryb minimalnie przetworzonych zależy przede wszystkim od temperatury ich przechowywania, im jest ona niższa, tym okres przydatności do spożycia jest dłuższy, czyli najdłuższy w przypadku mrożenia ryb. Ponadto wydłużenie okresu trwałości mikrobiologicznej ryb o małym stopniu przetworzenia umożliwia technologia pakowania próżniowego (VP), zastępowana coraz częściej przez technologię pakowania w modyfikowanej (MAP) i kontrolowanej atmosferze (CA) o optymalnym składzie gazów. Właściwie dobrana mieszanka gazowa w połączeniu z obniżeniem temperatury (chłodnicze przechowywanie) może wydłużyć okres trwałości ryb o kilka kluczowych dni, stanowiąc tym samym bardzo efektywny sposób wydłużania okresu przydatności do spożycia środka spożywczego.

Obecność bakterii chorobotwórczych, m.in. Listeria monocytogenes w rybach i produktach rybnych, sugeruje konieczność stałego monitorowania wszystkich etapów produkcji i dystrybucji, głównie pod względem przestrzegania dobrych praktyk higienicznych.

Listeria monocytogenes

Według obecnie obowiązującej systematyki Bergey’a rodzaj Listeria obejmuje 23 gatunki. Bakterie z rodzaju Listeria to Gram-dodatnie (w starszych hodowlach spotyka się także komórki Gram-ujemne), nieprzetrwalnikujące, krótkie pałeczki z tendencją do polimorfizmu. Występują pojedynczo lub w parach, mogą układać się także w krótkie łańcuszki (3-5 komórek bakteryjnych). Pałeczki z rodzaju Listeria są urzęsione perytrychalnie i nie wytwarzają otoczek.

Bakterie z rodzaju Listeria są w naturze wszechobecne. Występują powszechnie w glebie, wodzie, osadach morskich, a nawet ściekach. Z uwagi na powszechność występowania Listeria sp. bardzo ważne jest, aby już na etapie surowca i dalszego przetwarzania żywności przeprowadzać szczegółowe kontrole, które ograniczą ryzyko zanieczyszczenia produktu finalnego. Nie jest to jednak proste zadanie, ponieważ pałeczki z rodzaju Listeria są bakteriami doskonale adaptującymi się do niekorzystnych warunków środowiska.

Pałeczki Listeria monocytogenes są etiologicznym czynnikiem listeriozy. Listerioza jest zoonozą. Do zakażenia może dojść podczas bezpośredniego kontaktu z zainfekowanymi wydzielinami/wydalinami chorego zwierzęcia, np. podczas jego pielęgnacji, a także po spożyciu zakażonych surowych, wędzonych ryb i innych produktów wtórnie zanieczyszczonych podczas cyklu produkcyjnego, począwszy od pozyskiwania surowca, warunków przetwarzania, po transport i magazynowanie do dystrybucji finalnego środka spożywczego. To właśnie nieodpowiednio przetworzona i przechowywana żywność stanowi główne źródło zakażenia chorobotwórczymi szczepami Listeria sp. Również ludzie zdrowi mogą być bezobjawowymi nosicielami Listeria monocytogenes (bakterie występują głównie w pochwie i przewodzie pokarmowym, rzadziej w układzie oddechowym). Szacuje się, że około 5 – 10% populacji ludzi jest nosicielami tego gatunku. 

Wirulentne właściwości Listeria monocytogenes umożliwiają jej pokonanie trzech barier obronnych organizmu: błony śluzowej jelit, bariery naczyń krwionośnych w mózgu (bariera krew-mózg) oraz bariery łożyskowej.

Dawka infekcyjna chorobotwórczych szczepów Listeria sp. nie jest dobrze poznana i różni się w zależności od szczepu, a także od wrażliwości osobniczej gospodarza. Z danych epidemiologicznych wynika, że chorobotwórcze szczepy bakterii z gatunku Listeria monocytogenes należą do serotypów: 1/2a, 1/2b, 4b. Listerioza u człowieka może przybierać postać: nieinwazyjną (przebieg łagodny, nierzadko bezobjawowy o samoograniczającym się charakterze) i inwazyjną (przebieg ostry). Listerioza inwazyjna jest związana z populacjami immunologicznie wrażliwymi do których należą kobiety w ciąży, płody, noworodki, niemowlęta, osoby w podeszłym wieku, osoby z obniżoną odpornością. Dawka infekcyjna dla tych osób mieści się w przedziale 102 do 103 żywych komórek. Z chorób odzwierzęcych, właśnie listerioza stanowi najwyższy odsetek hospitalizowanych przypadków (97%), z najwyższym współczynnikiem śmiertelności (20 - 30%).
Podsumowując, kliniczna infekcja Listeria monocytogenes zależy od trzech głównych czynników:

• liczby bakterii przyjętych m.in. z żywnością
• patogennych właściwości szczepu związanych z rodzajem serotypu
• immunologicznego statusu chorego

Zastosowanie techniki PCR do wykrywania Listeria monocytogenes w rybach, produktach rybnych i środowisku przetwórstwa rybnego cz 2

Źródlo i fot.: Intertek