Zastosowanie techniki PCR do wykrywania Listeria monocytogenes w rybach, produktach rybnych i środowisku przetwórstwa rybnego cz 2
Wymagania prawne - Listeria monocytogenes w żywności
Rozporzadzenie Komisji (WE) NR 2073/2005
Przedsiębiorstwa sektora spożywczego są zobowiązane dopilnować, aby środki spożywcze były zgodne z odpowiednimi kryteriami mikrobiologicznymi.
Jeśli jest to konieczne, przedsiębiorstwa sektora spożywczego odpowiedzialne za wytwarzanie danego produktu powinni prowadzić badania zgodnie z załącznikiem II w celu zbadania zgodności z kryteriami w ciągu całego okresu przydatności do spożycia. Dotyczy to w szczególności wyrobów gotowych do spożycia, w których możliwy jest wzrost Listeria monocytogenes i które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na obecność Listeria monocytogenes.
Wymagania prawne - Listeria monocytogenes w środowisku produkcji i obrotu żywnością
Rozporzadzenie Komisji (WE) NR 2073/2005
Próbki pobierane są z obszarów produkcyjnych oraz ze sprzętu wykorzystywanego do produkcji żywności wówczas kiedy jest to konieczne dla zapewnienia spełnienia kryteriów.
Przedsiębiorstwa sektora spożywczego produkujące żywność gotową do spożycia, która może stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na obecność Listeria monocytogenes, pobierają próbki z obszarów produkcyjnych oraz sprzętu w celu sprawdzenia obecności Listeria monocytogenes w ramach stosowanych przez nie schematów pobierania próbek.
Wymagania prawne - Wykrywanie Listeria monocytogenes, a możliwość wykorzystania metod alternatywnych
Rozporzadzenie Komisji (WE) NR 2073/2005
Wykorzystanie alternatywnych metod analitycznych jest dopuszczalne, pod warunkiem ich zwalidowania w odniesieniu do metod referencyjnych wymienionych w załączniku I oraz jeśli metoda jest certyfikowana przez stronę trzecią zgodnie z protokołem zawartym w normie EN/ ISO 16140 lub z innymi podobnymi protokołami uznanymi w skali międzynarodowej.
Jeśli dane przedsiębiorstwo sektora spożywczego zamierza stosować inne metody analityczne niż metody walidowane i certyfikowane, metody te muszą być zatwierdzone zgodnie z protokołami uznanymi w skali międzynarodowej, a ich stosowanie musi być zatwierdzone przez właściwy organ.
Obecność bakterii chorobotwórczych, m.in. Listeria monocytogenes w rybach i produktach rybnych, sugeruje konieczność stałego monitorowania wszystkich etapów produkcji i dystrybucji, głównie pod względem przestrzegania dobrych praktyk higienicznych.
Częstotliwość badania powierzchni produkcyjnych na obecność patogenu Listeria monocytogenes zależy od kilku czynników:
- rodzaju wytwarzanego środka spożywczego (surowy, minimalnie przetworzony, RTE, wysoko przetworzony, poziom aktywności wody, pH i in.), istotą jest również stopień przetworzenia surowca
- możliwości zanieczyszczenia krzyżowego
- podczas procesu mycia i dezynfekcji należy zwrócić szczególną uwagę na trudno dostępne miejsca w środowisku produkcji (nisze ekologiczne do wzrostu Listeria monocytogenes). Pałeczki z rodzaju Listeria mogą trwale bytować: w szczelinach/ mikropęknięciach, w których zawsze gromadzi się wilgoć (istotą jest jakość i kondycja powierzchni), na pojemnikach używanych do przechowywania żywności oczekującej na dalsze przetwarzanie lub pakowanie, w kratkach ściekowych, wyłącznikach, na kółkach wózków i podnośników widłowych, również w ewentualnych zastoinach wody, na powierzchniach gumowych (bardzo ważny jest rodzaj materiału, z którego wykonana jest instalacja technologiczna), w niedokładnie wyrównanych miejscach połączeń spawanych i in., i zanieczyszczać środowisko produkcji
- częstotliwości prowadzenia zabiegów mycia i dezynfekcji pomieszczeń i wyposażenia.
Wyeliminowanie potencjalnych dróg mikrobiologicznego zanieczyszczenia, dzięki zachowaniu aseptycznych warunków produkcji w zakładzie, prawidłowej higieny personelu, a także przestrzeganiu procedur bezpieczeństwa, umożliwia otrzymanie bezpiecznego produktu, który nie zagraża zdrowiu, czy życiu konsumenta.
Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction)
Część technologii przetwarzania wykorzystywanych w przetwórstwie ryb umożliwia powstanie środków spożywczych o krótkich terminach przydatności do spożycia, m.in.: filety z ryb świeżych, ryby wędzone na gorąco, wyroby garmażeryjne i in. W tej sytuacji czas ma ogromne znaczenie i tu z pomocą przychodzą metody biologii molekularnej. Większość metod molekularnych bazuje na technice PCR (ang. Polymerase Chain Reaction). Łańcuchowa reakcja polimerazy jest skutecznym narzędziem wykrywania, identyfikacji i różnicowania pałeczek Listeria monocytogenes.
Klasyczna analiza mikrobiologiczna (PN-EN ISO 11290-2) choć uznana za niezawodną i skuteczną, wymaga kilku dni (min. 4 dni – do uzyskania wyniku ujemnego), a czasem i kilkunastu do momentu uzyskania ostatecznego rezultatu. Zdarza się, że fenotypowe cechy stanowiące kryterium identyfikacji nie ulegają ekspresji, co uniemożliwia prawidłową diagnozę. Innym problemem są tzw. formy VBNC (ang. Viable But NonCulturable) („żywe, lecz nie dające się hodować”). Konwencjonalne metody hodowlane (płytkowe) pozwalają na oznaczenie zaledwie 1-10% składu populacji stanowiącej określony ekosystem. Znaczna część mikroorganizmów aktywna metabolicznie, jest niezdolna do wzrostu w postaci kolonii na pożywkach agarowych. Przejście komórek od pełnej aktywności fizjologicznej do stanu VBNC zachodzi głównie w stresogennych warunkach środowiska (np. jako skutek procesu dezynfekcji w zakładzie produkcji). Komórki drobnoustrojów chorobotwórczych w fazie VBNC pozostają metabolicznie aktywne. Osiąganie przez szczepy patogenne stadium VBNC stanowi poważny problem zdrowotny, zwłaszcza, że komórki te cechuje większa wirulencja w porównaniu do komórek o pełnej aktywności fizjologicznej. Zastosowanie metod analitycznych (np. PCR) pozwalających precyzyjnie wykryć bakterie w stanie VBNC przyczynia się do znacznej poprawy kontroli bezpieczeństwa zdrowotnego żywności.
Metoda opiera się na powieleniu (amplifikacji) specyficznego dla danego gatunku fragmentu DNA in vitro. Warunkiem przeprowadzenia reakcji PCR jest znajomość sekwencji krótkiego fragmentu DNA na końcach 5’ i 3’, który może być powielony.
Do przeprowadzenia reakcji PCR są potrzebne:
- matryca – dwuniciowa cząstka DNA, której fragment chcemy powielić,
- startery (primery) – krótkie, jednoniciowe fragmenty DNA o długości około 10-20 nukleotydów i sekwencji komplementarnej do matrycowego DNA,
- substraty reakcji w postaci mieszaniny 4 nukleotydów (A – adenina, G – guanina, C – cytozyna, T – tymina), czyli dNTP,
- enzym katalizujący reakcję. Termostabilna polimeraza DNA, która na bazie jednoniciowego DNA, będącego matrycą, syntetyzuje nić komplementarną. Najczęściej używa się polimerazy z Thermus aquaticus, tzw. Taq polimeraza,
- reagenty pomocnicze takie jak np. jony Mg2+.
PCR jest reakcją cykliczną (etapy tworzą cykle, które są wielokrotnie powtarzane). Każdy cykl zwykle składa się z trzech etapów (kolejne etapy reakcji PCR wyznaczane są przez zmianę temperatury):
- Denaturacja matrycowego DNA. Wysoka temperatura (około 95oC) powoduje zerwanie wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi zasadami podwójnej helisy (dsDNA) (ang. double-stranded DNA), produktem są dwie cząsteczki jednoniciowe (ssDNA) (ang. single-stranded DNA)
- Hybrydyzacja starterów (przyłączanie primerów – ang. annealing) (często tj. 45 - 65oC). Do jednoniciowych cząsteczek matrycowego DNA przyłączane są startery.
- Wydłużenie łańcucha (elongacja). Temperatura tego etapu cyklu zależy od właściwości polimerazy. Dla polimerazy Taq optymalną jest temperatura 72oC.
Polimeraza dobudowuje kolejne nukleotydy do starterów – następuje synteza nici komplementarnych do nici matrycowej. Kierunek syntezy: 5’→ 3’.
Cykl powtarza się około 40 razy w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać. Dodatkowo wyróżnia się dwa etapy, które następują po wykonaniu odpowiedniej ilości cykli:
- Końcowe wydłużanie (temperatura działania polimerazy). Jego celem jest naprawienie ewentualnych pomyłek, które powstały przy syntezie komplementarnych nici DNA oraz renaturację wszystkich cząstek ssDNA do matrycowego DNA.
- Schładzanie, które zapobiega degradacji produktów PCR.
Teoretycznie ilość produktu po każdym cyklu amplifikacji powinna rosnąć wykładniczo (po n cyklach z jednej cząsteczki DNA powstaje jej 2n kopii), jednak w wyniku wyczerpania się składników reakcji spada aktywność polimerazy, tym samym obniża się wydajność amplifikacji. W klasycznym PCR analiza ilości powielonego produktu prowadzona jest dopiero po zakończeniu wszystkich cykli reakcji, czyli w fazie plateau. Z kolei zastosowanie real-time PCR pozwala na monitorowanie ilości amplifikowanego DNA po każdym cyklu reakcji przy użyciu barwników fluorescencyjnych. Intensywność sygnału fluorescencyjnego jest proporcjonalna do ilości produktu reakcji.
Należy jednak pamiętać, że techniką PCR jest wykrywane także DNA z martwych komórek bakteryjnych, które nie stanowią zagrożenia dla zdrowia publicznego. Jednak ten problem również można rozwiązać, uwzględniając rozcieńczenie próbki związane z etapem jej przednamnażania (wzbogacenie hodowli w żywe komórki docelowego patogenu, tj. 106-107 jtk/ml hodowli, przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości komórek martwych). Etap izolacji DNA to kolejne rozcieńczenia, a do samej reakcji PCR wykorzystujemy mikroobjętości lizatu, co skutkuje dalszym rozcieńczeniem próbki wyjściowej. Całkowite rozcieńczenie próbki wyjściowej wynosi zatem kilka tysięcy razy.
Komplikacją poprawnej detekcji patogenów w żywności i środowisku jej produkcji mogą być inhibitory reakcji PCR znajdujące się w matrycach żywnościowych oraz w środkach myjących i dezynfekujących. Problem ten rozwiązano poprzez dodawanie do reakcji PCR wewnętrznej kontroli amplifikacji IAC (ang. Internal Amplification Control). IAC PCR dopuszcza niezależną amplifikację w tej samej mieszaninie reakcyjnej docelowej sekwencji DNA i kontroli wewnętrznej przy wykorzystaniu tego samego zestawu starterów. Nadrzędną zaletą IAC PCR jest zwiększenie czułości reakcji PCR. Jednocześnie wewnętrzna kontrola amplifikacji zapobiega pojawianiu się wyników fałszywie ujemnych, związanych z obecnością inhibitorów reakcji PCR.
PCR pozwala uniknąć błędów diagnostycznych, co zasadniczo zwiększa bezpieczeństwo potencjalnego konsumenta eliminując wyniki fałszywie ujemne (omówione powyżej), tudzież zabezpiecza producentów żywności przed wynikami fałszywie dodatnimi, które potrafią naruszyć renomę przedsiębiorstwa i narazić je na ogromne koszty.
W podsumowaniu czas oczekiwania na wynik badania mikrobiologicznego, szczególnie istotny dla producenta żywności. Po etapie izolacji DNA, amplifikacja oraz detekcja zachodzą w termocyklerze w ciągu kilkudziesięciu minut. Całkowity czas wykonania oznaczenia razem z etapem przednamnażania to około 24 godziny (w przypadku wyniku ujemnego). Konieczne jest jednak potwierdzenie wyniku z etapu detekcji (w przypadku wyniku dodatniego). Ponadto PCR umożliwia wykrywanie specyficznej sekwencji DNA patogenów w żywności z wysoką selektywnością i specyficznością.
Źródlo i fot.: Intertek